斑马鱼行为轨迹分析系统应用于生物钟研究的典型案例

 

苏州大学:黄国栋 (发表于Autophagy,2016) 

研究背景:

生物钟(Circadian Clock)是生物为适应地球昼夜更替而演化成约24小时的内在计时机制。生物钟参与调节生物体诸如分子、生化、细胞、生理和行为等一系列生命过程。从斑马鱼(Danio rerio)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)和人类(Homo sapiens)等的研究中发现,生物钟的紊乱会导致机体功能失调从而可能引发诸如肥胖(Obesity)、家族性睡眠相位前移(Familial Advanced Sleep Phase)、季节性情感障碍(Seasonal Emotional Disorder))等疾病1-3。斑马鱼作为模式脊椎动物其生物钟系统的组成和运行机制同哺乳动物高度相似,它的成熟周期短、易于繁殖、胚胎透明、体外发育和独立于母体的胚胎生物钟是其特有的优势。

实验目的:

生物钟的一个重要的输出表现为运动行为的近24小时节律。模式动物斑马鱼、果蝇、小鼠均有明显的行为节律,而钟基因/生物钟相关基因的突变往往会影响生物体的行为节律。在持续黑暗(Constant darkness)条件下,生物体的行为节律会表现出无节律、周期延长/缩短或时相发生变化等。而在正常光暗条件下(Light/dark),由于外界光信号的输入,生物体多表现为不同程度的活动量改变。基于上述研究需求,我们利用斑马鱼行为分析系统(DanioVision, Noldus)来研究斑马鱼nr1d1/rev-erbα生物钟突变体可能存在的异常行为节律(运动轨迹、距离、速度、周期和时相)4

实验过程:

将3 dpf(Days post-fertilization)的斑马鱼幼鱼分为两组,对照组为48条野生型幼鱼(Wild-type,Tubulin品系)和实验组48条nr1d1突变体幼鱼置于96孔板中,随后将该96孔板放置于斑马鱼行为分析系统中,分别设置光强参数(Luminous Intensity)、循环水系统(Circulating Water System)、光周期时间(Light Cycling time)以及所需实验时间(Experiment time)即可开展实验。

*Noldus斑马鱼行为分析系统特有光强度调节参数、循环水装置和恒温设施是实验成功的必要条件。1. 合理设置斑马鱼分析系统中的光强参数,使置于系统中的斑马鱼幼鱼接受该分析系统中的光信号强度同实验室斑马鱼培养系统中的相一致,排除了光强异常对斑马鱼幼鱼行为的影响;2. 由于斑马鱼行为节律实验通常需要2个以上的连续光暗周期(24 hour/周期),循环水系统和控温系统能使96孔板中每条斑马鱼处于一个相对稳定的液体环境,同时还可以保证这96条斑马鱼所处一致的环境温度(温度也是重要的生物钟输入信号);3. 值得一提的是Noldus特有的软件系统,DanioVision拥有便捷的实验参数设置界面和优秀的后期分析功能,它为研究人员分析不同组别斑马鱼样本,从个体到整体,从视频到heatmap提供了便利。

实验结果与分析:

我们通过分析光暗条件下和持续黑暗条件下野生型幼鱼和nr1d1突变体幼鱼行为节律发现:
1.     正常光暗循环条件下nr1d1突变体幼鱼的活动量整体高于野生型幼鱼(~40%,
P<0.001)。同时,Noldus分析软件(DanioVision)还能单独分析每一条斑马鱼幼鱼的行为轨迹。我们发现在一个光暗周期的条件下,nr1d1突变体幼鱼在白天活动量提高了约50%,晚上提高了约30%。而且,该软件还能对监测视频分析并输出heatmap,更直观的呈现出野生型和nr1d1突变体幼鱼活动量的差异。
2.     持续黑暗条件下,我们发现野生型和nr1d1突变体幼鱼活动量也存在差异,其中几个重要的生物节律参数(周期、相位、振幅)均发生了改变。其中,nr1d1突变体幼鱼的周期为23.5小时,而野生型幼鱼的周期为23.8小时,它们间存在约0.25小时的缩短(P<0.05);而nr1d1突变体幼鱼的相位相比较野生型幼鱼显著的提高了约1.5小时(P<0.01);振幅方面nr1d1突变体幼鱼也比野生型幼鱼高(P<0.05)。
3.     药理学试剂deprenyl在神经性多巴胺异常,治疗生物体多动,注意力不集中方面有
4.     过多次的报道5。利用斑马鱼其特性,我们将deprenyl溶于斑马鱼培养液中,结果发现10 μM的deprenyl能将nr1d1突变体幼鱼所呈现出的高活动量恢复至野生型对照组相同程度的活动水平。

(Guodong Huang, et al, Autophagy, 2016)

讨论:

通过上述一系列的行为研究发现,斑马鱼生物钟基因nr1d1突变的幼鱼其行为较野生型有明显变化。在光暗周期条件下,nr1d1突变体幼鱼的活动量在光照条件和黑暗条件下均有明显升高;在黑暗周期条件下,nr1d1突变体幼鱼的相位、周期、振幅均有不同程度的变化,提示存在紊乱的生物钟系统;10μM的药理学试剂deprenyl能拯救因nr1d1突变所造成的行为异常,这对研究因时钟基因突变造成行为异常及药理学靶向药物治疗提供了线索。

参考文献:

1        Turek, F. W. et al. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice. Science 308, 1043-1045, doi:10.1126/science.1108750 (2005).
2        Xu, Y. et al. Modeling of a human circadian mutation yields insights into clock regulation by PER2. Cell 128, 59-70, doi:10.1016/j.cell.2006.11.043 (2007).
3        Zhang, L. et al. A PERIOD3 variant causes a circadian phenotype and is associated with a seasonal mood trait. Proc Natl Acad Sci U S A 113, E1536-1544, doi:10.1073/pnas.1600039113 (2016).
4        Huang, G., Zhang, F., Ye, Q. & Wang, H. The circadian clock regulates autophagy directly through the nuclear hormone receptor Nr1d1/Rev-erbalpha and indirectly via Cebpb/(C/ebpbeta) in zebrafish. Autophagy, 1-18, doi:10.1080/15548627.2016.1183843 (2016).
5        Huang, J. et al. Circadian modulation of dopamine levels and dopaminergic neuron development contributes to attention deficiency and hyperactive behavior. J Neurosci 35, 2572-2587, doi:10.1523/JNEUROSCI.2551-14.2015 (2015).